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Ricerca laboratorio di microbiologia

Nome del responsabile
Dott. Antonino Di Caro
Email: antonino.dicaro@inmi.it

Gli interessi scientifici generali coprono aspetti innovativi della diagnostica microbiologica molecolare, dello studio di fattori di virulenza batterica e delle interazioni parassita-ospite. Oggetto di particolare studio sono i batteri con resistenze multiple agli agenti antimicrobici (Acinetobacter, K. pneumoniae, P. aeruginosa) ed i micobatteri tubercolari.
Il settore di Microbiologia Molecolare si occupa della identificazione di microrganismi (batteri, miceti, protozoi) da campioni patologici mediante PCR ed analisi dei frammenti o sequenziamento genico. Le tecniche molecolari hanno integrato ed in parte sostituito le tecniche d’identificazione microbica basate sul fenotipo. In generale, i vantaggi offerti dalle tecniche molecolari sono la migliore risoluzione tassonomica a livello di specie, la maggiore velocità di esecuzione, ed in parte la semplificazione ed uniformità delle procedure (meno dipendenti dal campione da analizzare e dal microrganismo da ricercare) ed un contenimento dei costi ove applicate ad ampio spettro. Queste tecniche, inoltre, offrono l’incommensurabile vantaggio dovuto all’indipendenza dalla coltivazione del microrganismo, peculiarità che le rende applicabili anche all’identificazione di organismi non coltivabili (per caratteristiche intrinseche del microorganismo o per effetto dell’uso di agenti antimicrobici), oppure a crescita lenta. Inoltre, tale tecnologia permette di identificare microrganismi emergenti per i quali non sono ancora disponibili metodi affidabili d’identificazione fenotipica. Presso il laboratorio di Microbiologia dell’INMI è stato sviluppato, a fronte di uno studio della corrente letteratura scientifica ed alla nostra esperienza nel settore, un protocollo articolato per l’estrazione di acidi nucleici da vari materiale biologici e per la successiva identificazione dei patogeni con sistemi di amplificazione sia real-time che classica. Quest’ultima integrata con tipizzazione molecolare (MALDI-TOF, MLST, core genome MLST, rep-PCR, MIRU, etc) e con sequenziamento genico classico o WGS consente, se appropriato, un’approfondita caratterizzazione molecolare degli agenti patogeni sia dalle colture, che direttamente dai campioni biologici.

L’unità svolge principalmente ricerca applicata allo sviluppo ed alla valutazione di nuove tecnologie per la diagnostica e l’epidemiologia molecolare delle infezioni ad eziologia microbica e per la caratterizzazione di ceppi batterici MDR o la valutazione di efficacia di nuovi farmaci o nuove combinazioni antibatteriche. Particolari campi di interesse sono la micobatteriologia, l’identificazione e caratterizzazione di patogeni associati alle patologie nosocomiali e lo studio di patogeni batterici rari/emergenti, alcuni dei quali di rilievo anche ai fini del bioterrorismo.
Il laboratorio di microbiologia offre supporto diagnostico per numerosi progetti di ricerca dell’istituto in ambito nazionale ed internazionale quali ad esempio quelle condotte nell’ambito della collaborazione con la Cooperazione Italiana in Tanzania e agli interventi per l’emergenza Ebola in Italia e nell’Africa occidentale.
A seguito dell’acquisizione del MALDI-TOF siamo entrati a far parte del gruppo di lavoro nell’ambito del progetto europeo QUANDHIP e successivamente della Joint Action EMERGE che si occupa della messa a punto e standardizzazione dei criteri di identificazione con tecniche proteomiche dei patogeni emergenti e di interesse bioterroristico.
L’acquisizione del sistema semiautomatizzato DiversiLab (bioMérieux) nel 2014 ha permesso una notevole semplificazione nella tipizzazione di batteri patogeni con ampie possibilità di elaborazione, archiviazione e recupero dei dati. Il sistema offre la possibilità di produrre grafici in più formati (matrici di similarità, dendrogrammi, etc) che consentono una “clusterizzazione” di tipo gerarchico degli isolati per stabilire la vicinanza o distanza genetica fra gli isolati oggetto del fingerprinting. Il DiversiLab utilizza un software web-based, per cui è possibile confrontare i propri fingerprinting anche con altri presenti nel web. I vantaggi della REP-PCR, consistono nella facilità esecutiva, nella facile interpretabilità, nella elevata riproducibilità, nella applicabilità ad un ampio numero di specie (es. Acinetobacter baumannii, Clostridium difficile). Inoltre sempre a partire dallo stesso anno è stato predisposto un servizio di outsourcing per l’analisi WGS di DNA batterico, cui segue l’analisi effettuata presso il laboratorio. Questa procedura consente tipizzazioni più accurate ed analisi dei geni di resistenza e dei fattori di virulenza.

Lo strumento CFX96 system (BioRad) permette mediante un test multiplex Real-time PCR la rapida identificazione e distinzione tra Micobatteri tubercolari ed atipici. Inoltre permette la rilevazione delle resistenze di Mycobacterium tuberculosis (MTB) ai farmaci antitubercolari di prima (isoniazide e rifampicina) e di seconda (fluoroquinoloni e farmaci iniettabili) linea.

Il sistema automatizzato GT-Blot della Arnika permette di automatizzare le metoche di ibridazione su strip finalizzate all’identificazione delle diverse specie di Micobatteri non tubercolari ed alla rilevazione delle resistenze genetiche ai farmaci.

Coord. Tecnico/Infermieristico:
Dr.ssa Roberta Chiappini
Email: roberta.chiappini@inmi.it
Telefono: +39.06.55170314
Fax 06.5599340

Dirigenti
Dott. Eugenio Bordi
Dott.ssa Maria Grazia Paglia
Dott.ssa Carla Nisii
Dott.ssa Stefania Carrara
Dott.ssa Silvia D’Arezzo

Telefono: 06.55170675
Fax: 06.55170683

Microbiology Research Laboratory

General scientific interests cover advanced aspects of the clinical pathology in molecular microbiology, the study of bacterial virulence factors and the interactions parasite-host. Main targets of study are bacteria with multi-resistance to anti-microbial agents (Acinetobacter, K. pneumoniae, P. aeruginosa) and Mycobacterium tuberculosis.
Molecular Microbiology focuses on identifying microorganisms (bacteria, mycetes and protozoa) from pathologic samples through PCR and analysis of fragments or gene sequencing.

Molecular techniques have integrated and partly substituted the microbial identification techniques that were phenotype-based. Generally, the advantages offered by the molecular techniques are a better taxonomic resolution, a simplification and uniformity of procedures (less dependent of the sample to be analysed and of the microorganism to be researched) as well as low costs applied to a vast camp. Besides, these techniques offer a boundless advantage, which it is due to being independent from the microbial culture, peculiarities that can be applied either to the identification of non-cultivable organisms (due to intrinsic microorganism’s characteristics or to the effect of antimicrobial agents’ usage) or to a slow growth.

Likewise, this technology allows the identification of emerging microorganisms for which there are not available affable frameworks for phenotype identification yet.
In our laboratory, given the current study in the scientific research and our experience, it has been developed an articulated protocol to extract nucleuses acids from different biological materials and to identify sequential pathogens with real-time or standard amplification systems. The last, fused with molecular typifying (MALDI-TOF, Ml-ST, core genome Ml-ST, re-PCR, MIRU, etc.) and with a classic gene sequencing or WGS, consents, if necessary, a thorough molecular characterization of pathogen agents either for culture collections or directly from biologic samples.

We focus on applied research by developing and evaluating new technologies for diagnosis and molecular epidemiology of infectious diseases, particularly in the microbial aetiology field and MDR strain characterization, or we aim attention to new drugs’ efficiency assessing and to antibacterial combinations.
Our main interests are mycobacteriology, identification and characterization of pathogens associated to nosocomial pathologies, and the study of rare/emerging bacterial pathogens, some of them as potential tools in bioterrorism field.
Microbiology laboratory offers diagnostic support for many Institute’s research projects that are developed nationally and internationally, for example working together with the Italian Cooperation in Tanzania and intervening in Ebola emergency in Italy and in West Africa.

We are part of the European project QUANDHIP after buying MALDI-TOF, and consequently, we are associated with the Join Action EMERGE that deals with defining and standardizing, through proteomic techniques, the identification criteria for emerging and interest-bearing bioterrorism pathogens.
Acquiring the semiautomatic system DiversiLab (bioMérieux) in 2014, it has allowed a great simplification of typifying the bacterial pathogens and with strong possibilities for elaborating, archiving, and recovering of data. The system offers the possibility to produce graphics in different formats (similarity matrixes, dendograms, etc.) and allows a hierarchical model-based clustering of the isolates in order to establish a genetic variability between them, which it is the fingerprinting target. DiversiLab makes use of a web-based software that allows web-fingerprinting confrontation.

The REP-PCR’s advantages are simple performance, clear interpretation, high reproduction and applicability to a great number of species (ex. Acinetobacter baumannii, Clostridium difficile). In addition, since 2014, we have run an outsourcing service to analyse the WGS of bacterium DNA , to whom entails the analysis in the laboratory. This tool allows accurate molecular typifying analysis of the resistance genes and virulence factors.

The appliance CFX96 system (BioRad) allows through a multiplex real-time test PCR a fast identification and distinction between tubercular and atypical Mycobacteria. It also identifies the antibiotic resistance of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and rifampin as well as to fluoroquinolones and injectable second line-drugs.
Arnika’s GT-Blot allows fully automatic hybridization of samples on stripes in order to have a further labelling of Mycobacteriosis species and identification of antibiotic-resistance genes.

Coord. Tecnico/Infermieristico:
Dr.ssa Roberta Chiappini
Email: roberta.chiappini@inmi.it
Telefono: +39.06.55170314
Fax 06.5599340

Dirigenti
Dott. Eugenio Bordi
Dott.ssa Maria Grazia Paglia
Dott.ssa Carla Nisii
Dott.ssa Stefania Carrara
Dott.ssa Silvia D’Arezzo

Telefono: 06.55170675
Fax: 06.55170683

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